Προεμφυτευτικός γενετικός έλεγχος (PGT) και εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF)

ΟΟπροεμφυτευτικός γενετικός έλεγχος (PGT) είναι μια επεμβατική μέθοδος που περιλαμβάνει την ανάλυση του γενετικού προφίλ των εμβρύων που προκύπτουν από την εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF). Για να πραγματοποιηθεί η ανάλυση, είναι απαραίτητο να μεσολαβήσουν δύο επιπλέον στάδια πριν από την εμβρυομεταφορά. Το πρώτο περιλαμβάνει τη βιοψία του εμβρύου για την αφαίρεση ενός ή μερικών κυττάρων, που είναι αντιπροσωπευτικά ολόκληρου του εμβρύου, και το δεύτερο τη μοριακή ή κυτταρογενετική ανάλυση των κυττάρων αυτών.

Η ιδέα για την απομόνωση κυττάρων από το έμβρυο με επακόλουθη ανάλυση του γενετικού υλικού των κυττάρων αυτών πιστώνεται στους Gardner και Edwards. Οι δύο επιστήμονες κατάφεραν να προσδιορίσουν το φύλο εμβρύων κουνελιού έπειτα από βιοψία στο στάδιο της βλαστοκύστης. Στα μέσα της δεκαετίας του 1980 τόσο η δυνατότητα απομόνωσης του DNA κυττάρων όσο και η δυνατότητα πολλαπλασιασμού του DNA με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR – Polymerase Chain Reaction) άνοιξε την πόρτα για την εφαρμογή του προεμφυτευτικoύ γενετικού ελέγχου (PGT) στον άνθρωπο.

Η πρώτη κλινική εφαρμογή της προεμφυτευτικής γενετικής διάγνωσης (PGD – Preimplantation Genetic Diagnosis) πραγματοποιήθηκε το 1990 από την ομάδα του Handyside et al για φυλοσύνδετο νόσημα. Η βιοψία πραγματοποιήθηκε σε τρίτης ημέρας έμβρυα και, έπειτα από έλεγχο για το φύλο του εμβρύου, πραγματοποιήθηκε μεταφορά στην ενδομητρική κοιλότητα μόνο των θηλυκών-υγιών εμβρύων.

Από αυτή τη μελέτη προέκυψαν οι πρώτες επιβεβαιωμένες κυήσεις έπειτα από προεμφυτευτικό γενετικό έλεγχο. Εκτός από την ανίχνευση μονογονιδιακών νοσημάτων στα έμβρυα, αναπτύχθηκε παράλληλα η αντίληψη ότι θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί έλεγχος του γενετικού προφίλ του εμβρύου (PGS – Preimplantation Genetic Screening). Η μεταφορά ευπλοειδικών εμβρύων θα μείωνε την πιθανότητα αποβολής και τη μείωση του ψυχικού stress από επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης.

Η τεχνική FISH (Fluorescense In Situ Hybridization) έδωσε τη δυνατότητα ανίχνευσης μερικών από τα χρωμοσώματα που εμπλέκονται σε σύνδρομα και επαναλαμβανόμενες αποτυχίες, ωστόσο σε μετέπειτα μελέτες αποδείχθηκε η αποτυχία της μεθόδου να αυξήσει τα ποσοστά επιτυχίας της εξωσωματικής γονιμοποίησης. Η τεχνική της ενίσχυσης ολόκληρου του γονιδιώματος (WGA – Whole Genome Amplification) ευνόησε την εφαρμογή νέων τεχνικών υψηλής διακριτικής ικανότητας για τη μελέτη της συνολικής πλοειδίας του εμβρύου και τη δομή των χρωμοσωμάτων. Μερικές από τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη μελέτη αριθμητικών και δομικών χρωμοσωμικών αλλαγών είναι οι μικροσυστοιχίες συγκριτικού γενωμικού υβριδισμού (array CGA) και αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS).

PGT μπορεί να πραγματοποιηθεί σε υπογόνιμα ή μη υπογόνιμα ζευγάρια που είναι φορείς φυλοσύνδετου ή αυτοσωμικού μονογονιδιακού νοσήματος (PGT-M) ή φορείς κάποιας χρωμοσωμικής ανωμαλίας (PGT-SR). Επίσης, μπορεί να εφαρμοστεί σε περιπτώσεις πολλαπλών αποβολών πρώτου τριμήνου, σε ζευγάρια με πολλαπλούς αποτυχημένους κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης, καθώς και σε ζευγάρια όπου η γυναίκα είναι προχωρημένης ηλικίας (>40 έτη) για έλεγχο ολόκληρου του χρωμοσωμικού προφίλ του εμβρύου (PGT-A).

Τέλος, ο προεμφυτευτικός γενετικός έλεγχος μπορεί να εφαρμοστεί για έλεγχο εμβρύων για νοσήματα όψιμης εμφάνισης και για την επιλογή εμβρύων που είναι ελεύθερα του γενετικού νοσήματος της οικογένειας και ταυτόχρονα ιστοσυμβατά με ήδη πάσχον παιδί (HLA-typing).

Επιλογή σταδίου για βιοψία εμβρύων

Η βιοψία μπορεί να πραγματοποιηθεί στο στάδιο του ζυγώτη, σε τρίτης ημέρας έμβρυα (στάδιο αυλάκωσης) και σε πέμπτης ημέρας έμβρυα (στάδιο βλαστοκύστης). Η βιοψία των πολικών σωματίων στο στάδιο του ζυγώτη είναι πιο αποδεκτή από ηθικής πλευράς, εφόσον δεν αφαιρείται υλικό από το μελλοντικό έμβρυο, αλλά παραπροϊόντα της μείωσης, τα οποία είναι αντιπροσωπευτικά του μητρικής προέλευσης γονιδιώματος. Ωστόσο, σε αυτή την περίπτωση δεν ελέγχεται το πατρικής προέλευσης γονιδίωμα, καθώς και πιθανές βλάβες που είναι πιθανό να προκύψουν κατά τις πρώτες μιτωτικές διαιρέσεις.

Η βιοψία πολικών σωματίων είναι ευρέως διαδεδομένη σε κράτη όπου απαγορεύεται η βιοψία σε έμβρυα σταδίου αυλάκωσης ή βλαστοκύστης. Η δυσκολία αφαίρεσης και των δύο πολικών σωματίων σε σύγκριση με τις άλλες δύο τεχνικές, αλλά και η δυσκολία ερμηνείας των αποτελεσμάτων σε μερικές περιπτώσεις, έχουν οδηγήσει στον παραγκωνισμό της τεχνικής. Η βιοψία τρίτης ημέρας εμβρύων ήταν η πιο διαδεδομένη μέθοδος και σήμερα υπάρχει αρκετή πείρα με αρκετά καλά αποτελέσματα. Σε αυτή την περίπτωση αφαιρείται ένα κύτταρο από το σύνολο των 8 κυττάρων που απαρτίζουν το έμβρυο σε αυτό το στάδιο. Η ανάλυση του DNA από ένα και μοναδικό κύτταρο, καθώς και η αφαίρεση ενός σχετικά μεγάλου μέρους από το έμβρυο (1/8) θεωρούνται μερικά από τα αρνητικά της βιοψίας στο στάδιο της αυλάκωσης.

Επίσης, δεν γνωρίζουμε ποια είναι η συνεισφορά του κυττάρου που αφαιρούμε στο σύνολο του εμβρύου, με αποτέλεσμα να αγνοούμε και την πιθανή επίπτωση της βιοψίας στην εξέλιξη και ικανότητα εμφύτευσης του συγκεκριμένου εμβρύου. Η βιοψία κυττάρων τροφοεκτοδέρματος από έμβρυο σταδίου βλαστοκύστης έχει αρχίσει να εφαρμόζεται σε επίπεδο ρουτίνας στην πλειονότητα των εργαστηρίων, καθώς προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τις άλλες δύο τεχνικές. Σε αυτή την περίπτωση η βιοψία πραγματοποιείται σε έμβρυα που έχουν αποδεδειγμένα τη μεγαλύτερη δυναμική εφόσον έχουν εξελιχθεί μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης. Η αφαίρεση ενός μικρού ποσοστού κυττάρων από το σύνολο της βλαστοκύστης (5/150) και η αφαίρεση κυττάρων που προορίζονται να δώσουν μόνο εξωεμβρυϊκούς ιστούς (τροφοεκτόδερμα) είναι μερικά από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου. Σύμφωνα με βιβλιογραφικές αναφορές, η βιοψία στο στάδιο της βλαστοκύστης δεν επηρεάζει στατιστικά σημαντικά το ποσοστό εμφύτευσης των εμβρύων σε αντίθεση με τη βιοψία τρίτης ημέρας εμβρύων.

Η λήψη επαρκούς DNA για την επακόλουθη μοριακή ανάλυση οδηγεί σε πιο ακριβή και αξιόπιστα αποτελέσματα, με μεγαλύτερη επαναληψιμότητα, καθώς και σε δυνατότητα πιο αποτελεσματικής ανίχνευσης μωσαϊκών εμβρύων. Τα τελευταία χρόνια γίνεται προσπάθεια ελέγχου εμβρύων με μη επεμβατικές μεθόδους, όπως η ανάλυση του υγρού της βλαστικής κοιλότητας, καθώς και του καλλιεργητικού υγρού που περιβάλλει το έμβρυο. Και στις δύο περιπτώσεις το DNA που λαμβάνεται, είναι χαμηλής ποιότητας είτε γιατί εμφανίζει υψηλό βαθμό κατακερματισμού είτε γιατί μπορεί να εμφανίζει υψηλό βαθμό πρόσμιξης με μητρικό DNA. Υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν ότι το DNA αυτό προκύπτει από απόπτωση κυττάρων που φέρουν χρομωσωμικές ανωμαλίες, ωστόσο αυτό αμφισβητείται από πιο πρόσφατες μελέτες.

Προς το παρόν τα αποτελέσματα από την ανάλυση του DNA με τις υπάρχουσες τεχνικές τίθενται σε αμφισβήτηση και δεν μπορούν να συσχετιστούν με την ικανότητα εμφύτευσης των εμβρύων.

Ποσοστό επιτυχίας έπειτα από προεμφυτευτικό γενετικό έλεγχο

Ο PGT για έλεγχο κληρονομούμενων μονογονιδιακών νοσημάτων και δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών ανεξαρτήτως παράγοντα υπογονιμότητας θεωρείται σήμερα επιβεβλημένος για την αποφυγή πιθανής διακοπής της κύησης. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Εταιρεία Ανθρώπινης Αναπαραγωγής (ESHRE) σε περιπτώσεις που οι γονείς φέρουν κάποια δομική χρωμοσωμική ανωμαλία (PGT-SR), ένα μικρό μέρος (~60%-65%) από το σύνολο των ωοληψιών θα καταλήξει σε μεταφορά φυσιολογικού εμβρύου.

Σύμφωνα πάντα με αυτά τα δεδομένα, αναμένουμε ένα συνολικό ποσοστό κύησης 18% ανά ωοληψία και 28% ανά εμβρυομεταφορά. Νοείται ότι μικρές αποκλίσεις μπορούν να παρατηρηθούν ανάλογα με τον τύπο της χρωμοσωμικής ανωμαλίας. Σε περίπτωση μονογονιδιακού νοσήματος τα αποτελέσματα είναι σαφώς καλύτερα. Πιο συγκεκριμένα, αναμένουμε σε ποσοστό >90% των εμβρύων που υπόκεινται σε βιοψία να έχουμε διάγνωση, κάτι που εξαρτάται από την ποιότητα των εμβρύων. Επίσης, το 80% κύκλων PGT-Μ θα καταλήξουν σε εμβρυομεταφορά με ποσοστά επιτυχίας ~25% ανά ωοληψία και ~30% ανά εμβρυομεταφορά.

Η ανάλυση ολόκληρου του χρωμοσωμικού προφίλ του εμβρύου (PGT-A) έπειτα από βιοψία βλαστοκύστης αποτελεί σήμερα την πιο αποτελεσματική μέθοδο επιλογής εμβρύων προς μεταφορά. Με αυτή την τεχνική είναι δυνατό να επιλεγούν ευπλοειδικά έμβρυα, τα οποία έχουν και τη μεγαλύτερη δυνατότητα εμφύτευσης. Το ποσοστό εμφύτευσης ευπλοειδικών εμβρύων είναι >60%, όταν το αντίστοιχο ποσοστό στην απλή εξωσωματική γονιμοποίηση είναι περίπου 25%. Σε μια προσπάθεια εξωσωματικής, περίπου 45%-50% των εμβρύων είναι ευπλοειδικά, ποσοστό όμως που είναι άμεσα εξαρτώμενο από την ηλικία της γυναίκας.

Η εισαγωγή της μεθόδου αλληλούχισης νέας γενιάς (Next Generation Sequencing – NGS) για την ανίχνευση αριθμητικών και δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών έχει βοηθήσει σημαντικά στην αναγνώριση μωσαϊκών εμβρύων. Τα μωσαϊκά έμβρυα προκύπτουν από λάθη που πραγματοποιούνται κατά τις πρώτες μιτωτικές διαιρέσεις, ενώ η συμβολή των λαθών αυτών στο χρωμοσωμικό προφίλ του εμβρύου εξαρτάται από τη χρονική στιγμή κατά την οποία πραγματοποιούνται. Θεωρητικά, όσο πιο νωρίς συμβαίνει ένα λάθος στον κύκλο των μιτωτικών διαιρέσεων του εμβρύου τόσο μεγαλύτερη είναι η συμβολή του στο γονιδίωμά του.

Εάν ένα μωσαϊκό έμβρυο κρίνεται κατάλληλο για μεταφορά ή όχι, εξαρτάται από το πόσα και ποια χρωμοσώματα εμπλέκονται στον μωσαϊκισμό, αλλά και το ποσοστό της μωσαϊκότητας. Ενδεικτικά, έμβρυα που εμφανίζουν μωσαϊκότητα 20%-40% εμφανίζουν ποσοστό εμφύτευσης 56%, ενώ έμβρυα με ποσοστό 40%- 80% σαφώς μικρότερο ποσοστό 22%. Συνήθως, δίνεται προτεραιότητα στα ευπλοειδικά έμβρυα, ενώ τα έμβρυα που εμφανίζουν μικρού ρίσκου μωσαϊκότητα μεταφέρονται σε δεύτερο χρόνο. Η βιβλιογραφία για αυτό το θέμα δυστυχώς παρέχει αντικρουόμενα αποτελέσματα. Η πλειονότητα των μελετών αφορούν συγκεκριμένες ηλικιακές ομάδες και καλής πρόγνωσης ασθενείς, ενώ τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ανά κύκλο εμβρυομεταφοράς αντί για αρχόμενο κύκλο εξωσωματικής γονιμοποίησης, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε παρερμηνείες των αποτελεσμάτων. Επίσης, το ποσοστό εμφύτευσης ευπλοειδικών εμβρύων δεν είναι 100%, ενώ το ποσοστό αποβολών έπειτα από PGT-A είναι περίπου 6%. Είναι παραδεκτό ότι η μέθοδος αυτή οδηγεί σε μείωση του χρόνου απόκτησης παιδιού, στη μείωση των πολύδυμων κυήσεων και στη μείωση των αποβολών σε σύγκριση με την κλασική εξωσωματική γονιμοποίηση. Ωστόσο, η μέχρι σήμερα τεχνολογία έχει αποτύχει να βελτιώσει τα αθροιστικά ποσοστά επιτυχίας ανά αρχόμενο κύκλο εξωσωματικής γονιμοποίησης, ενώ παράλληλα το κόστος παραμένει αρκετά μεγάλο.

Σύμφωνα με τη μεγαλύτερη τυχαιοποιημένη μελέτη που έχει δημοσιευθεί μέχρι σήμερα και αφορά σε PGT-A σε πολικά σωμάτια ωαρίων γυναικών προχωρημένης ηλικίας (36-40), υποστηρίζεται ότι η μέθοδος αυτή απέτυχε να αυξήσει το ποσοστό ζώντων γεννήσεων σε σύγκριση με την κλασική εξωσωματική γονιμοποίηση, ωστόσο βοήθησε στη μείωση των αποβολών και των κύκλων θεραπείας. Τέλος, σύμφωνα με ανακοίνωση της Αμερικάνικης Ένωσης Αναπαραγωγικής Ιατρικής (ASRM) μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα που να συνιστούν την εφαρμογή βιοψίας βλαστοκύστης σε συνδυασμό με έλεγχο όλων των χρωμοσωμάτων σε όλα τα υπογόνιμα ζευγάρια.

References

  1. Gardner RL, Edwards RG. Control of the sex ratio at full term in the rabbit by transferring sexed blastocysts. Nature, 1968; 218: 346-349.
  2. Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985; 230: 1.350-1.354.
  3. Li HH, et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature, 1988; 335: 414-417.
  4. Handyside AH, et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature, 1990; 344: 768-770.
  5. Wells D, et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation. Nucleic Acids Res, 1999; 27: 1.214-1.218.
  6. Fiorentino F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertil Steril, 2014; 101: 1.375-1.382.
  7. Handyside AH. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertil Steril, 2013; 100: 595-602.
  8. Scott RT Jr, et al. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril, 2013; 100: 624-630.
  9. Liu W, et al. Non-invasive pre-implantation aneuploidy screening and diagnosis of beta thalassemia IVSII654 mutation using spent embryo culture medium. Ann Med, 2017; 49: 319-328.
  10. Vera-Rodriguez M, et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Hum Reprod, 2018; 33: 745-756.
  11. Hammond ER, Shelling AN, Cree LM. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Hum Reprod, 2016; 31: 1.653-1.661.
  12. De Rycke M, et al. ESHRE PGD Consortium data collection XIV-XV: cycles from January 2011 to December 2012 with pregnancy follow-up to October 2013. Hum Reprod, 2017; 32: 1.974-1.994.
  13. Dahdouh EM, Balayla J, Garcia-Velasco JA. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertil Steril, 2015; 104: 1.503-1.512.
  14. Munne S, et al. Detailed investigation into the cytogenetic constitution and pregnancy outcome of replacing mosaic blastocysts detected with the use of high-resolution next-generation sequencing. Fertil Steril, 2017; 108: 62-71 e8.
  15. Munne S, Wells D. Detection of mosaicism at blastocyst stage with the use of high-resolution next-generation sequencing. Fertil Steril, 2017; 107: 1.085-1.091.
  16. Verpoest W, et al. Preimplantation genetic testing for aneuploidy by microarray analysis of polar bodies in advanced maternal age: a randomized clinical trial. Hum Reprod, 2018; 33: 1.767-1.776.
  17. Practise Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology. The use of preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A): a committee opinion. Fertil Steril, 2018; 109: 429-436.

Κλείστε ραντεβού

Προγραμματίστε το ραντεβού σας σήμερα.

ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΗΣΤΕ ΜΑΖΙ ΜΑΣ